Staranje krvotvornih matičnih celic je odvisno od njihovega mikrookolja

Mojca Justin in Simona Miceska, Zavod RS za transfuzijsko medicino

Staranje krvotvornih matičnih celic je odvisno od njihovega mikrookolja

Staranje je kompleksen več faktorski proces, ki je posledica različnih, med seboj dopolnjujočih se vzrokov. Prične se na molekulski ravni in vodi v okvare celic, tkiv in celotnega organizma. Molekularni mehanizmi, ki so vpleteni v staranje celic, vključujejo poškodbe DNA, celično senescenco, krajšanje telomer, epigenetske spremembe, spremembe v mikroRNA, spremembe v zaznavanju hranil in metabolizmu, zmanjšano število mitohondrijev in njihovo disfunkcijo, spremembe v koncentraciji različnih parakrinih dejavnikov, izgubo celične polarnosti in proteostaze. En izmed pomembnejših dejavnikov staranja je tudi izčrpanje zaloge matičnih celic, ki obnavljajo poškodovana tkiva in s tem ohranjajo homeostazo v telesu. V zadnjem času je vse več raziskav o staranju posvečeno iskanju s starostjo povezanih sprememb v mikrookolju-niši matičnih celic, v katerem se nahajajo. Prav to je tudi področje, s katerim se ukvarja naša raziskovalna skupina na Zavodu za transfuzijsko medicino. Natančneje, preučujemo nišo najbolje raziskane skupine matičnih celic-krvotvornih matičnih celic v kostnem mozgu.
Krvotvorni sistem dnevno proizvede več kot 100 milijard zrelih krvnih celic, ki skrbijo za prenos kisika, imunsko obrambo ter remodelacijo tkiv. Krvotvorne matične celice (KMC) se nahajajo v posebnem mikrookolju, imenovanem niša, ki ohranja ravnotežje med mirovanjem, samo-obnavljanjem in diferenciacijo KMC, iz njih pa v procesu hematopoeze nastanejo vse tri vrste krvnih celic, eritrociti, levkociti in trombociti. So torej na vrhu hierarhične lestvice, njihova sposobnost samoobnavljanja pa jim omogoča nadomeščanje propadlih krvnih celic skozi celotno življenje. Posebno mikrookolje z nizkim deležem kisika jih ohranja v nizko metaboličnem stanju in s tem preprečujejo njihovo izčrpanje ter kopičenje mutacij, ki lahko vodijo v maligno preobrazbo celic. Nišo KMC sestavljajo različni tipi celic, kot so mezenhimske stromalne celice, adipociti, endotelne celice, perivalskularne stromalne celice, regulatorni T limfociti, makrofagi/monociti, megakariociti, Schwanove celice, osteoblasti, osteoklasti in komponente zunajceličnega matriksa. Te komponente niše s svojimi signali direktno in indirektno uravnavajo delovanje in usodo KMCjev, a točni mehanizmi delovanja še niso dokončno razjasnjeni.
S staranjem organizma prihaja do velikih sprememb v delovanju KMC. KMC se diferencirajo predvsem v mieloično vrsto in manj v limfatično vrsto, to pa vodi v zmanjšano število limfocitov, predvsem limfocitov T, ki so ključni za obrambo organizma pred patogeni. Starejši ljudje so zato zelo podvrženi infekcijskih boleznim. Že dolgo časa je znano, da starost darovalca KMC pri alogenskih presaditvah vpliva na uspešnost presaditve. KMC starejših darovalcev se namreč težje vsadijo v prejemnikov kostni mozeg in niso sposobne uspešno proizvajati novih krvnih celic. Notranji mehanizmi ki povzročijo staranje KMC, opisani v prvem odstavku, so že nekaj časa zelo dobro opisani. Danes je znano, da na staranje KMC pomembno vplivajo tudi zunanji dejavniki v niši, a še niso dobro raziskani. V zadnjih letih je postalo jasno, da tudi starost prejemnika KMC izjemno vpliva na uspešnost presaditve. V niši kostnega mozga namreč s staranjem prihaja do velikih sprememb, med drugim do zmanjšane tvorbe kostnega tkiva in razrasti maščobnega tkiva, spremeni se sestava in razmerje celic niše in koncentracije izločenih parakrinih dejavnikov, ki vplivajo na homeostazo KMCjev, sestava zunajceličnega matriksa in drugo. Pomembno vprašanje za znanstvenike, tudi za nas, je kaj se zgodi z mladimi KMC, ko jih presadimo v star kostni mozeg in v kolikšni meri stara niša vpliva oz povzroči disfukcijo in nezmožnost mladih KMCjev, da vzpostavijo normalno hematopoezo.
Študije, ki vključujejo presaditev kostnega mozga se izvajajo na živalskih modelih, najpogosteje na miškah. Ker so presaditve kostnega mozga na živalskih modelih zelo zahtevne in dolgotrajne, poleg tega pa je vse več poudarka na zmanjšanju uporabe poskusnih živali, poskušamo v naši skupini ponazoriti presaditve KMC in vitro. Tega se lotimo tako, da naredimo 2D kulturo celotnega kostnega mozga, jo gojimo cca 3-4 tedne ter nato v to kulturo dodamo KMC. Izolacijo kostnega mozga izvedemo v sterilnih pogojih. Izoliramo kosti obeh stegnenic, golenic, nadlahtnic, črevnici ter hrbtenico, ki jih nato očistimo vezivnega tkiva, mišic in maščobe ter s postopkom trenja kosti jih (ob dodatku hranilega gojišča) zdrobimo na fragmente, da se iz kosti sprostijo celice kostnega mozga. Tako izolirane celice nasadimo v gojilne posodice in jih gojimo v ustreznih pogojih, kjer tvorijo t.i. in vitro niše kostnega mozga. Te niše sestavljajo fibroblasti, endotelne celice, imunokompetentne celice, mezenhimske stromalne celice, adipociti in osteoblasti. KMC pridobimo na isti način, le da iz celotne celične populacije kostnega mozga izoliramo samo matične in progenitorske celice kostnega mozga. Po dodatku v nišomed celicami niše in KMC poteka prenos metabolitov in medcelična komunikacija, ki preprečuje diferenciacijo KMC in jim omogoča rast v kulturi. KMC namreč ne moremo pomnoževati in vitro brez ustrezne pritrjene plasti celic kostnega mozga.
Opazili smo, da starost miši vpliva na funkcionalne lastnosti niše KMC, predvsem na diferenciacijske sposobnosti mezenhimskih stromalnih celic, ki so del niše. Pri nišah starih miši smo v primerjavi z nišami mladih miši opazili povečano diferenciacijo mezenhimskih stromalnih celic v adipocite in ne v osteoblaste. Dobro poznano je dejstvo, da s staranjem v kostnem mozgu osteoblaste počasi začnejo nadomeščati adipociti, ki negativno vplivajo na delovanje KMC. Kaj povzroči ta diferenciacijski premik, še ni natančno znano. To pa je le ena izmed s starostjo povezanih sprememb v niši KMC, ki jo lahko zaznamo. Preučiti bo potrebno še številne druge funkcionalne, biološke in molekularne značilnosti pri stari in mladi niši, da jih lahko v celoti ovrednotimo.
Tovrstne in vitro niše lahko uporabimo kot model za preučevanje starostnih procesov pri miših, tudi pri človeku, da lahko ugotovimo kako starost niše oz. starost sprejemnika kostnega mozga vpliva na vzdrževanje in funkcionalne lastnosti darovalčevih KMC in posledično tudi na imunski sistem prejemnika.

2D kultura mišjih celic kostnega mozga, slikana z vrstičnim elektronskim mikroskopom.

Viri:
Rožman P, Jazbec K, Jež M. 2017. Stem cell aging. InTechOpen.
Rožman, P. 2018. The potential of non-myeloablative heterochronous autologous hematopoietic stem cell transplantation for extending a healthy life span. GeroScience.

Avtorici prispevka:
Mojca Justin je mlada raziskovalka na Zavodu RS za transfuzijsko medicino in vpisana v 2. letnik doktorskega študija Biomedicina na Medicinski fakulteti v Ljubljani. V svojem raziskovalnem delu doktorske naloge preučuje s starostjo povezane celične in molekularne mehanizme staranja krvotvornih matičnih celic ter njihovega mikrookolja v kostnem mozgu na mišjih modelih. Trenutno  raziskave izvaja na celičnih kulturah kostnega kostega mozga, kjer poskuša čim bolje ponazoriti pogoje kot so v organizmu, kasneje pa se bo posvetila tudi samim presaditvam krvotvornih matičnih celic na živalskih modelih. Raziskovalno delo je njena strast in s svojim delom želi prispevati k napredku znanosti na področju regenrativne medicine.
Simona Miceska je mlada raziskovalka na Onkološkem Inštitutu v Ljubljani na oddelku za citopatologijo, kjer se ukvarja s preučevanjem raka jajčnika. Pred tem je bila nekaj let zaposlena na Zavodu RS za transfuzijsko medicino, kjer je z navdušenjem preučevala procese staranja, 2D celične kulture, mezenhimske matične/stromalne celice ter izolacijo kostnega mozga. Za življenju in raziskovanje pravi: če pa ti v srcu ne gori močan ogenj, nima smisla poskušati.
Avtorici med delom v laboratoriju.
Mojca Justin je mlada raziskovalka na Zavodu RS za transfuzijsko medicino in vpisana v 2. letnik doktorskega študija Biomedicina na Medicinski fakulteti v Ljubljani. V svojem raziskovalnem delu doktorske naloge preučuje s starostjo povezane celične in molekularne mehanizme staranja krvotvornih matičnih celic ter njihovega mikrookolja v kostnem mozgu na mišjih modelih. Trenutno  raziskave izvaja na celičnih kulturah kostnega kostega mozga, kjer poskuša čim bolje ponazoriti pogoje kot so v organizmu, kasneje pa se bo posvetila tudi samim presaditvam krvotvornih matičnih celic na živalskih modelih. Raziskovalno delo je njena strast in s svojim delom želi prispevati k napredku znanosti na področju regenrativne medicine.