Piše dr. Martina Štampar, prejemnica Loreal-Unescove štipendije Za ženske v znanosti 2021

Kaj so genotoksične spojine in kako jih odkrivamo?

Ljudje smo vsakodnevno izpostavljeni številnim kemikalijam, zdravilom ter biološkim dejavnikom z mutagenimi ali kancerogenimi lastnostmi. Izpostavljenost takšnim spojinam lahko povzroči številne škodljive učinke na zdravje, med katere spadajo rakava obolenja, neplodnost, genetske okvare potomcev in številne druge. Zato igra ocena genetske toksičnosti snovi ključno vlogo pri določanju varnosti le-teh (Parker, 2014; Hoeijmakers, 2009; Wogan in sod., 2004)

Najprej bi vam rada predstavila pojem genotoksičnost. To je lastnost spojine, ki poškoduje genetski material. Deluje lahko neposredno, in sicer tako, da se veže na DNA in jo spremeni, npr. s prečnim povezovanjem, alkilacijo in prelomi, ali pa posredno, tako da vpliva na celične funkcije, kar vodi do poškodb DNA, npr. mitotični in topoizomerazni inhibitorji ter oksidativni stres. Genotoksične spojine v prvi vrsti povzročajo poškodbe DNA somatskih celic, kar vodi v staranje in poveča verjetnost za nastanek rakavega obolenja. Po drugi strani spremembe DNA v spolnih celicah vodijo v nastanek genetskih bolezni in doprinašajo h genetski obremenjenosti. Ocena genetske toksičnosti snovi pa je bistven del ocene varnosti različnih snovi (od farmacevtskih izdelkov, industrijskih kemikalij, pesticidov, biocidov, aditivov za živila, kozmetike do veterinarskih zdravil), na podlagi katere lahko ocenimo tveganje za nastanek rakavega obolenja in kemikalije razvrščamo v različne razrede ter jih označujemo v skladu s smernicami EU (Turkez in sod., 2017; Corvi in Madia, 2016).

Kako poteka testiranje genotoksičnosti snovi?

Standardni postopki za določanje genotoksičnosti vključujejo različna testiranja na in vitro modelih, ki vključujejo bakterijske in celične modele, na naslednji stopnji pa tudi testiranja na modelnih organizmih in vivo. Trenutno se in vitro testi genotoksičnosti izvajajo na presnovno nekompetentnih človeških celičnih linijah (kot je recimo TK6) ali na celičnih linijah glodalcev, ki imajo številne pomanjkljivosti ter so precej oddaljene od ljudi, zato lahko dajejo zavajajoče rezultate. Študije kažejo, da je nekje 80 % in vitro testov, ki pokažejo pozitivni rezultat, lažno pozitivnih. Posledično se zaradi teh lažno pozitivnih rezultatov toksičnosti nepotrebno testira večje število spojin z genotoksičnimi testi in vivo. To pomeni, da se veliko testov v pred kliničnih raziskavah opravi na živalih (npr. v ZDA zaradi testiranja umre več kot 100 milijonov živali letno). Temu nepotrebnemu testiranju bi se lahko izognili z zanesljivejšimi in vitro testnimi sistemi. Zato se v zadnjih desetletjih vedno bolj spodbuja razvoj novih učinkovitih testnih metod, saj en sam test ne zadostuje za odkrivanje vseh pomembnih genotoksičnih učinkov. Prav tako je vse večji poudarek na razvoju alternativnih in vitro celičnih modelov, ki se osredotočajo na genotoksične odzive kemikalij in onesnaževalcev okolja (Corvi in Madia, 2016; Turkez in sod., 2017; Freires in sod., 2017).

Tradicionalni celični 2D modeli za testiranje genotoksičnosti

Jetra so osrednji organ, kjer s pomočjo številnih encimov poteka presnova ksenobiotikov. Proces presnove je deljen na 4 faze, od katerih predvsem faza I (aktivacija) in faza II (detoksifikacija) vključujeta številne encime za presnovo. Glavna funkcija encimov, ki presnavljajo ksenobiotike, je pretvorba hidrofilnih spojin do bolj polarnih in v vodi topnih snovi, kar pa pogosto vključuje nastanek visoko reaktivnih intermediatov. Določene spojine tako postanejo toksične šele po aktivaciji z metabolnimi encimi faze I. Če ni ustreznega metabolizma faze II, se lahko vežejo na DNA ali beljakovine, kjer povzročajo poškodbe (Badal McCreath in Delgoda, 2017).

V toksikologiji se trenutno za določanje in vitro škodljivih učinkov kemikalij uporabljajo hepatocelularni dvodimenzionalni (2D) celični modeli. Lahko bi rekli, da še zmeraj veljajo kot nekakšen zlati standard za določanje genotoksičnosti snovi. V teh modelih se običajno celične kulture gojijo kot enosloj na ravni površini. Ta vrsta gojenja omogoča stik med celicami samo na njihovem obrobju, kar pa onemogoča rast celic v 3D obliki, ki je za organizme bolj naravna. Takšna oblika rasti ne odraža naravnega stanja celic v organizmih, zato lahko vpliva na številne celične procese, vključno z diferenciacijo celic, proliferacijo, apoptozo, ter tudi na izražanje genov in beljakovin (Mersch-Sundermann in sod., 2004; Knasmüller in sod., 1998).

Napredni 3D celični modeli

Na drugi strani pa se kot alternativni modeli pojavljajo napredni izboljšani in vitro 3-dimenzionalni celični modeli, z razvojem in karakterizacijo katerih smo se ukvarjali tudi v moji doktorski disertaciji. Med 3D oblike gojenja celic spadajo tudi sferoidi, ki predstavljajo enega najpogostejših načinov gojenja jetrnih celic v 3D obliki. Sferoidi so običajno sestavljeni iz različnih območjih v katerih se nahajajo celice. Zunanje območje sestavljajo proliferirajoče celice, potem sledi območje mirujočih in v sredini oz jedru sferoida je območje apoptotičnih in nekrotičnih celic. Ta območja nastanejo zaradi nižje difuzije hranil in kisika v središče sferoida. 3D oblika omogoča interakcije med celicami ter celicami in zunajceličnim matriksom, zaradi česar lahko sferoidi bolj realistično posnemajo naravno okolje in vivo in tako ustvarijo zapleteno mikrookolje. Posledično dajejo natančnejše rezultate v pogojih in vitro v primerjavi z 2D kulturami (Edmondson in sod., 2014; Breslin & O’Driscoll, 2013; Fey & Wrzesinski, 2012; Gong in sod., 2015; Shah in sod. 2018; Elje in sod. 2019; Mandon in sod. 2019; Hercog in sod., 2020).

Tako predstavljajo 3D celični modeli privlačno alternativo poskusom na živalih. Čeprav imajo 3D celični modeli več boljših lastnosti v primerjavi z 2D celičnimi modeli, jih je za nadaljnjo uporabo potrebno standardizirati. Predvsem jih je treba ustrezno ter kvalitetno okarakterizirati ter prilagoditi protokole gojenja, zaradi česar ti modeli na področju genetske toksikologije še zmeraj niso v vsesplošni uporabi. Z našimi raziskavami smo pomembno prispevali k izboljšanju celičnih in vitro modelov ter tako ponudili alternativo poskusom na živalih.

Viri:

Badal McCreath S., Delgoda, R. 2017. Drug Metabolism. Pharmacognosy: Fundamentals, Applications and Strategies. Academic Press, 527–544

Breslin S., O’Driscoll L. 2013. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today, 18(5-6): 240–249.

Corvi R., Madia F. 2016. In vitro genotoxicity testinge-Can the performance be enhanced? Food and Chemical Toxicology, 1–9.

Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., & Yang, L. (2014). Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. In Assay and Drug Development Technologies (Vol. 12, Issue 4, pp. 207–218). Mary Ann Liebert Inc. https://doi.org/10.1089/adt.2014.573

Elje E., Hesler M., Rundén-Pran E., Mann P., Mariussen E., Wagner S., Dusinska M., Kohl, Y. 2019. The comet assay applied to HepG2 liver spheroids. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 845.

Fey, S. J., & Wrzesinski, K. (2012). Determination of drug toxicity using 3D spheroids constructed from an immortal human hepatocyte cell line. Toxicological Sciences, 127(2), 403–411. https://doi.org/10.1093/toxsci/kfs122

Fontana, F., Marzagalli, M., Sommariva, M., Gagliano, N., & Limonta, P. (2021). In Vitro 3D Cultures to Model the Tumor Microenvironment. Cancers, 13(12), 2970.

Freires I. A., Sardi J. C., de Castro R. D., Rosalen P. L. 2017. Alternative Animal and Non-Animal Models for Drug Discovery and Development: Bonus or Burden? Pharmaceutical Research, 34(4): 681–686.

Gong, X., Lin, C., Cheng, J., Su, J., Zhao, H., Liu, T., Wen, X., & Zhao, P. (2015). Generation of Multicellular Tumor Spheroids with Microwell-Based Agarose Scaffolds for Drug Testing. PLOS ONE, 10(6), e0130348. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0130348

Hercog, K., Štampar, M., Štern, A., Filipič, M., & Žegura, B. (2020). Application of advanced HepG2 3D cell model for studying genotoxic activity of cyanobacterial toxin cylindrospermopsin. Environmental Pollution, 265, 114965. https://doi.org/10.1016/j.envpol.2020.114965

Hoeijmakers J. H. 2009. DNA Damage, Aging, and Cancer. The New England Journal of Medicine, 361: 1475–1485.

Knasmüller S., Parzefall W., Sanyal R., Ecker S., Schwab C., Uhl M., Mersch-Sundermann V., Williamson G., Hietsch G., Langer T., Darroudi F., Natarajan, A. T. 1998. Use of metabolically competent human hepatoma cells for the detection of mutagens and antimutagens. Mutation Research, 402: 185–202.

Mandon, M., Huet, S., Dubreil, E., Fessard, V., & Le Hégarat, L. (2019). Three-dimensional HepaRG spheroids as a liver model to study human genotoxicity in vitro with the single cell gel electrophoresis assay. Scientific Reports, 9(1). https://doi.org/10.1038/s41598-019-47114-7

Mersch-Sundermann V., Knasmüller S., Wu X.-j., Darroudi F., Kassie F. 2004. Use of a human-derived liver cell line for the detection of cytoprotective, antigenotoxic and cogenotoxic agents. Toxicology, 198: 329–340.

Parker L. 2014. The Impact of the Environment on Cancer Genomics. V: Cancer Genomics. Dellaire G. (ed.), Berman J.N. (ed.), Arceci R. J. (ed.). Halifax, Canada, Academic Press: 449-465

Shah, U. K., Mallia, J. de O., Singh, N., Chapman, K. E., Doak, S. H., & Jenkins, G. J. S. (2018). A three-dimensional in vitro HepG2 cells liver spheroid model for genotoxicity studies. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 825, 51–58. https://doi.org/10.1016/J.MRGENTOX.2017.12.005

Turkez H., Arslan M. E., Ozdemir O. 2017. Genotoxicity testing: progress and prospects for the next decade. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology, 13(10): 1089–1098.

Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., & Nguyen, N. T. (2017). Liquid marbles as bioreactors for the study of three-dimensional cell interactions. Biomedical microdevices, 19(2), 1-9.

Wogan G. N., Hecht S. S., Felton J. S., Conney A. H., Loeb L. A. 2004. Environmental and chemical carcinogenesis. Seminars in Cancer Biology, 14(6): 473–486.