Fotopretvorba barvila za barvanje celičnih jeder lahko privede do napačnih znanstvenih zaključkov

20. januar 2016
dr. Mojca Jež

Moderna medicina se vedno bolj usmerja od blaženja simptomov k dejanskemu odpravljanju vzrokov bolezni ter k obnovi poškodovanih tkiv in organov. Pri tem imajo veliko vlogo različne vrste celic, ki so kjučna sestavina zdravil za napredna zdravljenja. V človeškem telesu se nahaja več kot 200 različnih vrst celic. Kadar jih uporabljamo za zdravljenje je pomembno, da znamo ločiti različne vrste celic med sabo ter jih uspešno uporabiti pri regeneraciji. Ker samo na osnovi različnega izgleda ne moremo ločiti vseh vrst celic, jih ločujemo glede na to, katere označevalce izražajo na svoji površini ali v svoji notranjosti. Označevalec je določena molekula, ki je prisotna samo na/v izbrani vrsti celic.

K celicam dodamo protitelesa, ki prepoznajo označevalec (po principu ključ – ključavnica) in se nanj vežejo. Da pa to vezavo vidimo, so protitelesa označena s fluorecenčnim barvilom. Ko fluorescenčno barvilo osvetlimo z laserjem določene barve, zasveti. Barvila so lahko različnih barv, zato lahko hkrati barvamo različne molekule v celicah. Celice po barvanju opazujemo s fluorescenčnim mikroskopom, ki je opremljen z ustreznimi filtri, s katerimi zaznamo svetlobo, ki jo barvila oddajajo.

Dve zelo pogosti barvili, ki se za te namene uporabljata, sta barvilo FITC (fikoeritrin) in barvilo DAPI (celotno ime 4′,6-diamidino-2-fenilindol dihidroklorid). Barvilo FITC zasveti zeleno ob osvetlilitvi z modrim laserjem, barvilo DAPI pa modro ob osvetlitvi z UV laserjem. DAPI se močno veže na DNA (dedni zapis v celici) ter se pogosto uporablja za označevanje celičnih jeder.

Na levi strani slike je prišlo do fotopretvorbe barvila DAPI zato celična jedra zdaj svetijo zeleno, na desni pa ne in jeder zato ne vidimo.

Pred kratkim smo ugotovili, da pri določenih pogojih pride do pojava, ki smo ga imenovali fotopretvorba barvila DAPI in se le-to začne obnašati kot zeleno barvilo FITC. Ko smo celice obarvane z barvilom DAPI najprej pogledali pod setom filtrov za zeleno barvilo FITC, so bile celice neobarvane (desni del slike). Nato smo celice opazovali s setom filtrov za DAPI ter pričakovano opazili močno modro obarvana celična jedra. Ponovno smo zamenjali set filtrov na zelenega in opazili močno zeleno obarvana jedra (levi del slike). Ugotovili smo, da opazovanje pri UV svetlobi spremeni barvilo DAPI tako, da ga nato lahko opazujemo v zelenem kanalu.

Najbolj nas je presenetilo, da kljub temu, da sta barvili DAPI in FITC v uporabi že več deseteletij, nikjer v strokovni literaturi nismo zasledili opisov fotopretvorbe barvila DAPI. Menimo, da je pojav zelo pomemben, če ga namreč ne poznamo, lahko napačno interpretiramo rezultate poskusa. Tudi sami smo namreč ta pojav najprej zamenjali za obarvanje jedrnega proteina OCT4. Protein OCT4 v celičnem jedru je pomeben označevalec embrionalnih matičnih celic. Če se v nahaja v jedru neke celice, je to pomemben znak, da gre za matično celico s sposobnostjo za razvoj v vse celice človeškega telesa. Zaradi fotopretvorbe barvila DAPI smo najprej napačno menili, da se v celicah izraža OCT4 nato pa smo opazili, da če premaknemo preparat na drugi del, ki ga še nismo opazovali pod UV svetlobo, ne vidimo zelenega signala.

Ker se barvilo DAPI pogosto uporablja za ostrenje slike pri mikroskopiranju ter iskanje ustreznega območja za opazovanje, lahko fotopretvorba predstavlja resno težavo in generira lažno pozitivne rezultate. Temu pojavu se lahko izognemo tako, da uporabljamo nizko koncentracijo barvila DAPI za barvanje in da vedno najprej opazujemo ostale barve (rdečo, zeleno) ter šele kot zadnjo modro.

Prispevek je bil nagrajen na natečaju Znanost na delu.

Doktorica biotehnologije, ki je sprva verjela, da bo arhitektka. Na akademsko pot jo je zapeljalo mesto mlade raziskovalke na Zavodu RS za transfuzijsko medicino, oči pa so se ji dokončno odprle ob delu z matičnimi celicam v ZDA. Poleg sodelovanja pri razvoju celične terapije za zdravljenje srčnega popuščanja se ukvarja še z »anti aging« projektom, ki je tisti, zaradi katerega ne more spati in jo žene naprej. Znanost je peskovnik za odrasle, v katerem s svojim znanjem, kreativnostjo, idejami, razigranostjo in zagnanostjo ustvarjamo in spreminjamo naše razumevanje sveta ter gradimo prihodnost.